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重组卵白质的抒发、纯化、复性和定量

宣布者:艾美捷科技    宣布时候:2021-06-08     
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按操(cao)纵手册(ce)停止,详细(xi)步骤以下。


一、重组卵白质的引诱抒发


1.挑取转化(hua)有质粒的单菌落,接种于 3ml 挑选(xuan)性 LB 液(ye)体(ti)培育基中,37 oC,250rpm/min 振摇(yao)培育留宿。


2. 第二天(tian)将培(pei)(pei)育留宿的菌(jun)(jun)液 500 μl 再接种于 10 ml(1:::20)挑选(xuan)性 LB 液体培(pei)(pei)育基中,37 oC,250 rpm/min 振摇培(pei)(pei)育至(zhi)光(guang)密度(OD600=0.6)时,取(qu) 1 ml 样本(ben)作为(wei)引诱前标本(ben),10000g 离心 1 min 搜集菌(jun)(jun)体积淀(dian),-20 oC 冻(dong)存(cun)备(bei)用(yong)。


3. 插手 1 mol/L IPTG 于菌液(ye)中,使 IPTG 终浓度为 1 mM,37 oC,250 rpm/min振摇培育 4~5 小(xiao)时。取 1 ml 样本作为引诱后标(biao)本,同上(shang)法搜集菌体积(ji)淀,-20 oC 冻(dong)存备用。


4. 将引诱前(qian)后(hou)菌体积(ji)淀用 20 ~ 40 μl PBS(pH= 8.0)重(zhong)悬,插手等(deng)体积(ji)的 2×SDS上样缓冲(chong)液,煮沸加热(re) 5 min,SDS 聚丙烯酰(xian)胺凝(ning)胶(SDS-PAGE)电泳(yong)分(fen)手 ,考马斯亮蓝(lan)染色 3 小时(shi)后(hou),脱色察看(kan)成果。


5. 拔取引(yin)诱胜利的细菌(jun)克隆,扩展引(yin)诱范(fan)围,搜集菌(jun)体(ti)积淀,于(yu)-20 oC 保 存 ,筹办(ban)做下(xia)一步阐发及纯化(hua)。


二、重组卵白质的分手纯化


重组卵白质的可溶性判定

1.将按上法引诱培育后(hou)搜集的菌体重悬于裂解液 1 (Lysis buffer under nativeconditions )中,而(er)后(hou)在-80 oC 高温(wen)冰箱中安(an)排 10 min。


2. 冰中冻结。


3. 在冰浴上用超声破裂仪破菌 6 次,每次 10 sec,间歇 10 sec,电压 200-300 V。


4. 10000g,4oC,离心 20 min,取上清(为溶液 A), -20 oC 保管;另将积淀用一样裂解液 1 消融(为溶液 B),一样-20 oC 保管,供后继阐发利用。


5. 将上(shang)述 A、B 溶(rong)液和引诱前后的细菌停止 SDS-PAGE 电泳,考马斯(si)亮(liang)蓝染(ran)色(se),比拟阐(chan)发重组卵白(bai)质(zhi)(zhi)的消融性。若是引诱抒(shu)发的卵白(bai)质(zhi)(zhi)位于 A 溶(rong)液中,则(ze)为(wei)可溶(rong)性卵白(bai);若是是在 B 溶(rong)液中,则(ze)为(wei)非可溶(rong)卵白(bai)。


重组卵白质为非可溶性卵白(变性前提下)的分手纯化

1.将菌体积淀溶于适当裂解液 2(Lysis buffer under denaturing conditions )中,室温下搅拌和奏乐积淀,防止泡沫天生。


2. 10000g,4 oC,离心 30 min,搜集上清液。


3. 将 Ni-NTA Agarose 充填柱子,并毗连于 Pharmarcia 高压液相层析体系,用 5倍柱体积的裂解液 2 均衡 Ni-NTA Agarose,调理 A280 值至零线。


4.将适当上清液上样到 Ni-NTA Agarose 柱子中,并用 lysis buffer 冲刷至 A280值低于 0.01。


5. 别离用 5~10 倍柱体积的洗濯液 1 和洗濯液 2(Wash buffer 1 and 2)洗濯柱子,直至 A280 值低于 0.01。


6. 用洗脱液(Elution buffer)洗脱重组卵白质,在 A280 值监测下,搜集呈现峰线后含有重组卵白的一切洗脱液。


三、重组卵白质的复性、冻干和定量

纯(chun)化后(hou)的(de)卵白(bai)(bai)(bai)用梯度下降的(de)尿素溶(rong)液(ye)迟缓透(tou)(tou)析(xi),终(zhong)究(jiu)用 0.01×PBS 透(tou)(tou)析(xi),透(tou)(tou)析(xi)后(hou)的(de)卵白(bai)(bai)(bai)质溶(rong)液(ye)经(jing)冻干成粉状。以(yi)牛血洁白(bai)(bai)(bai)卵白(bai)(bai)(bai)(BSA)为规(gui)范,接纳 BIO-RAD 公司卵白(bai)(bai)(bai)质定(ding)(ding)量试剂(ji)(protein assay)比色测定(ding)(ding)卵白(bai)(bai)(bai)质的(de)含量。




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